對同一張組織切片上的兩種或多種抗原進行免疫組化定位，有多種酶學方法可供選擇。概括起來可分為兩大類： 
用相同的酶系統、不同的酶作用底物對每種抗原進行檢測，或用不同的酶系統及其相應的底物，對每種抗原進行檢測。 
目前Vector公司（國內代理商欣博盛生物）所提供的可廣泛選擇的VECTORSTAIN® ABC kit試劑盒及底物試劑盒，上述兩種方法都適用。 
Vector開發的許多獨-特的底物尤其適用于多抗原標記。通常，過氧化物酶底物能產生更穩定、更密集的有色沉積物而能對抗原進行精確定位；堿性磷酸酶底物較彌散；葡萄糖氧化酶相比而言靈敏度較低，但當使用高濃度的一抗時，也可作為第二種標記對抗原進行定位。 

雙抗原染色流程圖 

雙抗原染色實驗步驟 

1.組織標本制備。脫蠟、水化、抗原修復（可根據一抗說明書推薦方法進行操作）。 
2.在蒸餾水中清洗5分鐘。 
3.如存在內源酶活性，可采用適當方法以消除內源酶的作用。（如3％H2O2-甲醇液中浸泡10分鐘，以消除內源性過氧化氫酶的作用）。 
4.用PBS洗2 分鐘/次×3次（也可使用其他緩沖液）。 
5.Avidin/biotin封閉。 如有需要，可進行Avidin/Biotin封閉（Avidin/Biotin 封閉試劑盒，目錄號 SP-2001）。在Avidin溶液中孵育15分鐘。用緩沖液清洗，然后在Biotin 溶液孵育15分鐘。用PBS洗2 分鐘/次×3次。如已設置適當對照，背景不需考慮時，也可省去此步。 
6.蛋白封閉。用含5%正常血清的緩沖液孵育20分鐘。或在10%的正常血清中孵育5-10分鐘。 
7.一抗。甩去多余封閉液，滴加適當濃度的一抗（5%正常血清稀釋- VECTASTAIN® kit），室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。在蒸餾水中清洗5分鐘。 
8.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
9.二抗。滴加生物素化二抗，孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘，需升高生物素化二抗的濃度。 
10.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
11.加入ABC復合物（預先制備的VECTASTAIN® ABC試劑）。孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘，需提高試劑濃度。 
12.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
13.底物。用適當的酶底物進行孵育（可在顯微鏡下觀察至顯色最佳）。請根據底物試劑盒中推薦的時間做參考。 
14.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
15.（此步起，為對第2種抗原進行染色標記）Avidin/biotin封閉。此步可防止第2套標記試劑與第1套標記試劑相互作用。在蒸餾水中清洗5分鐘。 
16.蛋白封閉。用含5%正常血清的緩沖液孵育20分鐘。或在10%的正常血清中孵育5-10分鐘。用PBS洗2 分鐘/次×3次（也可使用其他緩沖液）。 
17.一抗。甩去多余封閉液，滴加適當濃度的一抗（5%正常血清稀釋- VECTASTAIN® kit），室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（或適當孵育時間）。 
18.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
19.二抗。滴加生物素化二抗，孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘，需升高生物素化二抗的濃度。 

20.加入ABC復合物（根據說明書預先制備的VECTASTAIN® ABC試劑）。孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘，需提高試劑濃度。 

21.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
22.底物。用適當的第2種酶底物進行孵育（可在顯微鏡下觀察至顯色最佳）。請根據底物試劑盒中推薦的時間做參考。 23.用自來水沖洗5分鐘。 
24.復染、鹽酸酒精分化、封片、鏡下觀察。

優質免疫化學檢測酶底物 
       Vector公司能提供過氧化物酶底物、堿性磷酸酶底物和葡萄糖氧化酶底物，以及DuoLuX 化學發光或熒光底物。可用于堿性磷酸酶，過氧化物酶和葡萄糖氧化酶。均為濃縮型，試劑盒內包括能配置成300ml工作液所需的所有試劑成分，足以染色3000-6000張片。試劑盒成分穩定，4℃可保存一年。酶底物反應物有可溶性和非可溶性，適合IHC、WB、ISH、ELISA等多種免疫化學檢測方法。

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